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Vers un nouveau médicament contre la tuberculose: pyridomycin natures isoniazide Résumé La tuberculose, une menace mondiale pour la santé publique, devient intraitable en raison de la résistance aux médicaments répandue aux médicaments de première ligne, tels que l'isoniazide InhA-inhibiteur. Historiquement, en inhibant des cibles très vulnérables, les produits naturels ont été une source importante d'antibiotiques, y compris les agents anti-tuberculeux puissants. Ici, nous décrivons pyridomycin, un composé produit par Dactylosporangium fulvum avec activité bactéricide spécifique contre les mycobactéries. En sélectionnant des mutants pyridomycin résistant de Mycobacterium tuberculosis. séquençage du génome entier et la validation génétique, nous avons identifié la enoyl - dépendante du NADH (Acyl-Carrier-Protein) réductase InhA comme la cible principale et démontrer que pyridomycin inhibe la synthèse des acides mycoliques chez M. tuberculosis. En outre, les études biochimiques et structurales montrent que InhA pyridomycin inhibe directement comme un inhibiteur compétitif du site de liaison à NADH, permettant ainsi d'identifier une nouvelle poche à druggable InhA. Fait important, les isolats résistantes à l'isoniazide les plus fréquemment rencontrés cliniques restent pleinement sensibles à pyridomycin, ouvrant ainsi de nouvelles voies pour le développement de médicaments. Le document explique Même aujourd'hui, l'infection par Mycobacterium tuberculosis comptes pour un maximum de deux millions de décès par an. L'efficacité des médicaments antituberculeux actuels pour lutter contre ces infections est de plus en plus compromise par la prévalence escalade de la tuberculose multi et ultrarésistante. Pour ces cas, les composés anti-tuberculeuses les plus efficaces, tels que l'isoniazide et la rifampicine ne sont plus efficaces, ce qui peut entraîner des taux de mortalité de près de 100 pour les patients atteints de tuberculose largement résistante aux médicaments. Pour ces raisons, il est impératif de veiller à ce que le pipeline de médicaments candidats pour traiter la tuberculose est bien remplie. Nous montrons ici que le pyridomycin produit naturel est un composé bactéricide très sélective contre les mycobactéries, y compris Mycobacterium tuberculosis. la bactérie responsable de la tuberculose chez l'homme. En sélectionnant et l'isolement des mutants M. tuberculosis résistantes à pyridomycin et le séquençage de leur génome, nous avons découvert qu'une seule mutation dans un gène nommé inhA est responsable de la résistance. InhA est déjà la cible de l'anti-tuberculose agent de première ligne isoniazide actuelle. Cependant, le plus intéressant, pas de résistance croisée n'a été observée entre les pyridomycin et l'isoniazide, à la fois dans des souches de laboratoire contenant des mutations dans InhA ou dans les isolats cliniques les plus fréquemment rencontrés isoniazide résistantes qui contiennent des mutations dans katG (un gène nécessaire pour activer l'isoniazide). Nous présentons ensuite des études génétiques et biochimiques détaillées pour confirmer que pyridomycin s'inhibe InhA et que, dans des bactéries vivantes, cette inhibition conduit à l'épuisement des acides mycoliques, un composant essentiel de la paroi cellulaire. Enfin, les études de la structure cristalline de la protéine InhA et le formulaire de pyridomycin résistant donnent des informations précieuses sur la poche de liaison de pyridomycin. L'inhibition de InhA est l'un des moyens les plus efficaces de tuer Mycobacterium tuberculosis. ce qui est le mécanisme derrière l'un des agents anti-tuberculeux les plus puissants actuellement utilisés: isoniazide. L'émergence croissante de la tuberculose multi et ultrarésistants (qui sont tous deux résistants à l'isoniazide) signifie que pour ces cas, cet objectif ne peut plus être efficacement inhibée par le traitement en cours. Notre conclusion que pyridomycin tue M. tuberculosis en inhibant InhA (même dans les isolats cliniques isoniazide résistant) fournit une base prometteuse pour le développement de pyridomycin ou un agent lié pour le traitement de la tuberculose résistante à l'isoniazide. INTRODUCTION Aujourd'hui, l'infection par Mycobacterium tuberculosis comptes jusqu'à deux millions de décès par an (Glaziou et al, 2009). facteurs de confusion majeurs tels que la pauvreté, l'itinérance et la prévalence du VIH / SIDA (Harrington, 2010) signifient que la tuberculose sera indéfiniment rester une cause importante de morbidité et de mortalité dans le monde entier. En outre, en dépit de la petite, mais de plus en plus certain nombre de médicaments qui sont efficaces pour tuer M. tuberculosis. le traitement actuel est encore alourdi par sa durée (généralement 6 mois pour les souches sensibles aux médicaments) et le nombre sans cesse croissant de multirésistance (MDR) et ultrarésistante résistants (XDR) isolats cliniques de M. tuberculosis (Cegielski, 2010). Ensemble, cela souligne la nécessité pour les entités thérapeutiques alternatives qui peuvent être utilisés à la fois pour raccourcir la durée du traitement et de lutter contre le problème croissant de la résistance aux médicaments cliniques. Les produits naturels ont longtemps fourni une riche source d'agents anti-tuberculeux efficaces. Les plus actifs d'entre eux en cours d'utilisation, les rifamycines (rifampicine, rifabutine et rifapentine), inhibent l'ARN polymérase et sont essentiels pour le traitement de première ligne de la maladie. En outre, plusieurs autres produits naturels tels que les aminoglycosides (streptomycine, amikacine et kanamycine) et l'antibiotique peptidique (capréomycine) font partie du portefeuille actuel de médicaments antituberculeux. La riche diversité de produits naturels représente un outil puissant pour la découverte de médicaments, d'une part, sous la forme de pistes pour les agents anti-microbiens potentiels et d'autre part, comme un moyen d'identifier les cibles qui sont les plus vulnérables dans la bactérie. En 1953, pyridomycin a d'abord été décrit comme un antibiotique qui présentait une activité spécifique contre les mycobactéries différents, y compris M. tuberculosis et M. smegmatis (Maeda et al, 1953). Pyridomycin (figure 1A) est produite par Streptomyces pyridomyceticus (Maeda et al, 1953 Yagishita, 1954, 1955, 1957a. B) ou Dactylosporangium fulvum (Shomura et al, 1986). Sa biosynthèse a été étudiée en 1968 (Ogawara et al, 1968) et plus récemment en 2011 (Huang et al, 2011) lorsque la participation des deux synthétases non ribosomiques peptidiques (NRPS) et polykétides synthases (PKS) a été proposé. Malgré ces travaux, le mécanisme d'action de pyridomycin contre M. tuberculosis est inconnu, et son potentiel en tant que composé anti-tuberculose n'a pas été évaluée. Figure 1. Structure chimique et l'activité intracellulaire de pyridomycin. Structure chimique de pyridomycin. L'activité intracellulaire de pyridomycin sur M. tuberculosis a été testée dans les macrophages THP-1 dérivés activés. Les cellules ont été infectées à une MOI de 1: 1 par M. tuberculosis Erdman et traités avec de l'isoniazide (INH) à 1 g / ml. unités formant colonie (UFC) ont été déterminés après 7 jours d'exposition aux médicaments. NT se réfère à l'échantillon non traité et NT0 à un échantillon non traité au temps 0. L'expérience a été effectuée en double et les résultats sont présentés comme des valeurs moyennes et les erreurs standards. Le but de cette étude était de déterminer comment pyridomycin tue M. tuberculosis et d'identifier sa cible. Pour ce faire, une combinaison d'approches impliquant la cartographie de la résistance, la validation génétique, la biochimie, l'inhibition de l'enzyme et X analyse cristallographique aux rayons de la cible sont décrits. Les résultats combinés indiquent sans ambiguïté que pyridomycin est un inhibiteur compétitif du site NADH contraignant de InhA, NADH-dépendante énoyl-Acyl-Carrier-Protein réductase, la cible des deux éthionamide anti-tuberculose pro-médicaments isoniazide et (Banerjee et al 1994 Vilcheze et al, 2006). RÉSULTATS Purification de pyridomycin Plusieurs souches de Streptomyces pyridomyceticus (NRRL B-2517, ISP-5024 et DSM40024) ont d'abord été testés pour pyridomycin production avec un succès limité, probablement en raison de la présence de la production et non-production de populations dans la même culture. Pyridomycin (figure 1A) est, cependant, facilement produit par Dactylosporangium et purifié à partir fulvum (NRRL B-16292) avec un rendement de 2099 et un spectre RMN tel que rapporté précédemment (Kinoshita et al, 1989). Les propriétés anti-bactériennes de pyridomycin Pyridomycin a été décrite pour agir spécifiquement contre les mycobactéries, avec peu ou pas d'activité contre d'autres espèces Gram-positives et Gram-négatives (Maeda et al, 1953). Afin de vérifier son spectre d'activité, l'essai de réduction de la résazurine de microplaques (REMA) a été utilisée pour déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) pour diverses bactéries. D'après le tableau 1. on peut clairement voir que pyridomycin est efficace contre tous les membres du genre Mycobacterium tuberculosis testés, y compris M. (souche H37Rv, MIC Maeda, 1957) et suggèrent que pyridomycin cible un composant mycobactérienne qui est soit suffisamment divergente ou absente dans d'autres genres. Tableau 1. sensibilité des bactéries aux pyridomycin telle que mesurée par la réduction de la résazurine essai de microtitrage Pyridomycin MIC (g / ml) Pour mieux comprendre les propriétés de pyridomycin contre M. tuberculosis. sa concentration minimale bactéricide (MBC) a été déterminée et son activité contre les non-réplicatif et intracellulaire M. tuberculosis mesurée. données MBC ont démontré que pyridomycin est bactéricide contre M. tuberculosis H37Rv à des concentrations de 0.62log (figure 1B). Pyridomycin est donc clairement en mesure d'entrer dans les macrophages et d'arrêter la réplication bactérienne. Cytotoxicité de pyridomycin sur des lignées cellulaires humaines Afin de déterminer si pyridomycin est cytotoxique pour les cellules humaines, la cytotoxicité dépendante de la concentration du composé a été évaluée sur deux lignées de cellules humaines. Les données indiquent que la quantité de pyridomycin nécessaire pour tuer 50 des cellules HepG2 (lignée de cellules hépatiques humaines) ou des cellules A549 (lignée cellulaire epitheliale de poumon humain) était de 100 et 50 mg / kg par injection intrapéritonéale (Maeda et al, 1953). Identification de la pyridomycin cible La stratégie visant à identifier la cible et le mécanisme d'action de pyridomycin était d'élever des mutants pyridomycin-résistants et d'identifier les mutations génétiques responsables de ce phénotype, anticipant que ces mutations seraient dans le gène de la cible de la drogue. mutants résistants de la souche H37Rv ont été sélectionnés sur milieu solide contenant pyridomycin à 106. Sur les 10 colonies sélectionnées pour une analyse ultérieure (PYR1 à 10), neuf ont montré aucun changement dans le MIC à pyridomycin lorsque re-testé par REMA, alors que le mutant PYR7 conservé une près de 10 fois plus de son niveau de résistance par rapport à la H37Rv (figure 2) parent. Ce phénotype a été maintenu de façon stable et mutant PYR7 est resté totalement sensible à l'isoniazide, la moxifloxacine et la rifampicine comme type sauvage H37Rv (figure 2). Figure 2. validation génétique de InhA comme cible de pyridomycin. La susceptibilité du composé de type sauvage H37Rv transformée avec les pMV261 vecteur de commande (carrés pleins), pMVinhA (carrés ouverts), pMVinhA (S94A) (triangle ouvert) ou pMVinhA (D148G) (cercle ouvert) à: (A) moxifloxacine, ( B) isoniazide ou (C) pyridomycin. La susceptibilité du composé de mutant pyridomycin résistant PYR7 transformé avec les pMV261 vecteur de commande (carrés pleins), pMVinhA (carrés ouverts), pMVinhA (S94A) (triangle ouvert) ou pMVinhA (D148G) (cercle ouvert) à: (D) moxifloxacine, (E) à l'isoniazide ou (F) pyridomycin. Pour identifier les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) ou insertion / suppression (INDEL) responsables de la résistance à la pyridomycin, les génomes des deux PYR7 et la souche parentale ont été séquences pour presque terminé par le protocole Illumina. Quatre-vingt-huit pour cent des lectures ont été cartographiés avec succès au génome de référence H37Rv (Cole et al, 1998) résultant en une couverture moyenne 300 fois. Comparaison des ensembles PYR7 et H37Rv a révélé 63 SNPs dont 53 mappé au PE répétitif et familles de gènes PPE et ont donc été rejetées. Sur les 10 SNP restants, neuf étaient synonymes. La seule mutation non synonyme a été trouvé une transition dans a443g inhA entraînant le remplacement de l'acide aspartique en position 148 par une glycine (D148G). Cette mutation faux-sens a ensuite été confirmée par séquençage Sanger classique. En ce qui concerne les structures déjà publiées du énoyl-ACP réductase NADH-dépendante InhA, Asp148 a été trouvé pour être situé près de la poche de liaison NADH (Dessen et al, 1995 Dias et al, 2007 Molle et al, 2010 Oliveira et al, 2006 Rozwarski et al, 1999 Vilcheze et al, 2006). validation génétique de InhA comme cible de pyridomycin Pour valider génétiquement InhA comme cible de pyridomycin, nous avons évalué que ce soit sur l'expression de inhA a provoqué une augmentation de la résistance à l'antibiotique de type sauvage dans M. tuberculosis. A cet effet, nous avons transformé la souche H37Rv avec un plasmide portant le gène inhA sous le contrôle du promoteur hsp60 (pMVinhA Larsen et al, 2002). Sur la figure 2, on peut voir que H37Rv :: pMVinhA affiche une 15 fois plus élevée pour les CMI pyridomycin par rapport à la souche témoin H37Rv :: pMV261 (0,31 à 5 la figure 2). Dans des expériences témoins, la surexpression de inhA a également conduit à une résistance accrue à l'isoniazide dans les deux souches, tout en n'impactant la CMI de la moxifloxacine (figure 2). Ensemble, ces données génétiques suggèrent fortement que InhA est la cible de pyridomycin. Pour corroborer en outre que la mutation D148G dans inhA est en effet responsable de pyridomycin résistance, nous avons surexprimé cet allèle dans H37Rv et comparé son effet à celui d'une mutation bien caractérisée associée à une résistance à l'isoniazide, InhA (S94A) (Vilcheze et al, 2006) . Les résultats présentés dans la figure 2 montrent clairement que, par rapport à la surexpression de type sauvage InhA (pMVinhA), la surexpression de InhA (D148G) provoque quatre fois plus grande résistance à la pyridomycin tandis surexpression de InhA (S94A) confère seulement une résistance à deux fois. En outre, la surexpression de InhA (D148G) n'a eu aucun impact sur la MIC pour l'isoniazide par rapport à la surexpression de type sauvage InhA, alors que, comme prévu, surexprimant InhA (S94A) une résistance accrue autour de quatre fois (figure 2). Aucun des mutations affecté la MIC pour la moxifloxacine (figure 2). Collectivement, ces données démontrent que la mutation D148G dans InhA est responsable de la résistance à la pyridomycin, sans pour autant affecter sensiblement l'activité isoniazide. En plus de l'isoniazide, InhA est également la cible de l'éthionamide et le triclosan. Des études de sensibilité à l'aide de ces composés sur H37Rv et PYR7 indiquent que les deux souches sont également sensibles à la CMI de 2,0 et 12,5 g / ml, respectivement. Cette absence de résistance croisée indique que D148G dans InhA est susceptible d'avoir aucune incidence sur la liaison à InhA soit triclosan ou le métabolite actif de l'éthionamide, le produit d'addition éthionamide-NAD. Susceptibilité des isolats cliniques isoniazide résistant à pyridomycin Depuis nos résultats indiquent que pyridomycin a la même cible que l'isoniazide, nous avons examiné si les isolats cliniques isoniazide résistantes de M. tuberculosis conservé la susceptibilité à pyridomycin. Comme l'isoniazide est un pro-médicament, les mutations cliniquement pertinentes qui confèrent une résistance sont fréquemment trouvés dans le gène katG codant pour la catalase15) t promoteur mutation affichée résistance croisée avec pyridomycin, alors que les (S315T) mutants plus communs résistantes à l'isoniazide katG ont conservé leur sensibilité complète à l'antibiotique. Tableau 2. Activité Pyridomycin contre des isolats cliniques résistants à l'isoniazide de M. tuberculosis L'inhibition de la synthèse des acides mycoliques par pyridomycin Il a été démontré que l'inhibition élégante de InhA par l'isoniazide dans M. tuberculosis conduit à l'appauvrissement spécifique des acides mycoliques à partir de la paroi cellulaire bactérienne sans affecter la synthèse des acides gras (Vilcheze et al, 2006). Pour montrer que l'inhibition de pyridomycin InhA entraîne également l'inhibition de la synthèse des acides mycoliques, la teneur en acide gras et mycoliques de M. tuberculosis a été déterminée en présence et en l'absence de pyridomycin par chromatographie sur couche mince radiométrique (CCM). Nous avons constaté que pyridomycin a provoqué une réduction de la synthèse des acides mycoliques dépendante de la concentration (alpha-, méthoxy - et les acides mycoliques céto-) tout en n'affectant la teneur en acide gras (figure 3). En outre, lors de l'exécution de la même expérience sur PYR7, plus de cinq fois supérieure à la concentration pyridomycin ont été nécessaires pour inhiber la biosynthèse des acides mycoliques en accord avec le niveau de résistance observé. Deux H37Rv et se sont comportés de manière similaire PYR7 lorsque l'essai a été répété en présence d'isoniazide (figure 3). En effet, celle-ci a entraîné une diminution dépendante de la concentration de la quantité d'acides mycoliques dans H37Rv et était également efficace pour inhiber la synthèse des acides mycoliques en PYR7. Pris ensemble, ces données confirment que la synthèse des cibles pyridomycin des acides mycoliques et démontrent que l'enzyme InhA (D148G) dans PYR7 est beaucoup moins sensible à l'inhibition pyridomycin. Figure 3. Inhibition de la synthèse de l'acide mycolique par pyridomycin. L'ester méthylique d'acide gras (EMAG) et de l'ester méthylique de l'acide mycolique (Mamés) profils de type sauvage H37Rv et mutant pyridomycin résistant PYR7 ont été évalués par chromatographie sur couche mince. Les deux souches ont été traitées avec différentes concentrations de l'isoniazide et pyridomycin pendant 3 heures et étiquetés avec le 1,2- 14 C-acétate d'éthyle. 14 FAME et Mamés C-marqués ont été séparés par chromatographie sur couche mince et détectés par autoradiographie. La quantification de l'intensité de la bande de MAME par rapport à la densité du FAME illustre l'inhibition de la synthèse par MAME pyridomycin (B) et de l'isoniazide (C) dans H37Rv (carrés noirs) et PYR7 (cercles ouverts). L'inhibition in vitro de InhA par pyridomycin Inhibition de InhA purifié par pyridomycin a été étudiée pour étudier si pyridomycin seul peut inhiber l'enzyme ou si bio-activation in vivo par un processus intracellulaire est nécessaire. InhA, InhA (S94A) et InhA (D148G) ont été exprimés avec succès et purifié. Les trois enzymes étaient oxydées catalytiquement actif et du NADH, en présence du substrat 2-trans octénoyle-CoA réductase (OcCoA). Les premières expériences ont déterminé la NADH-constante de liaison (K m) et a confirmé que pour InhA (S94A), il était environ 6,5 fois plus élevé que pour type sauvage InhA (tableau 3) tel que rapporté précédemment (Quemard et al, 1995 Rawat et al, 2003 Vilcheze et al, 2006). Étonnamment, nous avons trouvé que le K m de InhA (D148G) pour NADH était 14 fois plus élevée que pour type sauvage InhA (tableau 3), suggérant une plus faible affinité pour le NADH dans le mutant D148G. Toutes les enzymes ont un V semblable max (autour 0.52Burk parcelles (figure 4). Ces données montrent que pyridomycin est le pharmacophore qui inhibe InhA, et cette activité est réalisée par une inhibition compétitive du site de NADH de liaison. En outre, ces biochimiques et les résultats confirment que enzymologiques InhA (D148G) est plus résistant à pyridomycin tandis InhA (S94A) est aussi sensible que l'enzyme de type sauvage. Tableau 3. In vitro paramètres cinétiques de M. tuberculosis InhA et son inhibition par pyridomycin structures en cristal de InhA ( D148G), de type sauvage InhA et InhA (S94A) pour étudier plus en détail le mode de liaison de pyridomycin à InhA au niveau atomique, nous cristallisés et résolu les structures de type sauvage InhA et InhA (S94A) mutant dans un complexe avec NADH comme publié antérieurement (Dessen et al, 1995 Dias et al, 2007 Molle et al, 2010 Oliveira et al, 2006 Rozwarski et al, 1999 Vilcheze et al, 2006). dans une tentative pour obtenir des structures cristallines de InhA dans un complexe avec pyridomycin pré InhA - crystallized: NADH ou InhA (S94A): cristaux NADH ont été trempés dans une solution de pyridomycin. Sur la pénétration de pyridomicin, les cristaux se sont jaune, mais ont perdu leur capacité à diffracter. Ceci suggère que pyridomycin peut induire des changements majeurs de conformation lors de la liaison à la poche NADH co-facteur de InhA. Pour des fins de contrôle, InhA: cristaux NADH ont également été imbibés de triclosan, un inhibiteur du site de liaison au substrat énoyl-ACP de InhA, et la structure résolus avec succès, ce qui exclut les questions techniques avec trempage (données non présentées). Comme une stratégie alternative pour définir le site de liaison pyridomycin dans les tentatives de InhA ont été faites pour co-cristalliser InhA ou InhA (S94A) en présence d'pyridomycin seul ou avec le substrat octénoyle CoA cependant, en dépit de test de plus de 1000 conditions, aucun cristal de diffraction ont été obtenu à ce jour. La mutation D148G conduit à pyridomycin résistance ainsi qu'à une diminution de NADH affinité (tableau 3). Pour déterminer la base moléculaire de cette résistance, on cristallisés InhA (D148G), en présence ou en l'absence de NADH. Comme avec InhA et InhA (S94A), nous avons obtenu des cristaux seulement en présence de NADH et résolu l'INHA (D148G): la structure NADH à 2,54 (figure 5). Dans le cas contraire, les positions des autres résidus du site actif ainsi que la structure globale de la protéine étaient identiques (données d'appui sur la figure 1). Figure 5. structures en cristal de InhA (D148G) par rapport au type sauvage InhA et InhA (S94A). La carte de densité d'électrons 2fo-fc à 1 sigma de InhA (D148G): la structure NADH (à 2,45) avec Phe149 et NADH représenté comme des bâtons. Superposition de InhA (D148G): NADH (bleu) InhA: NADH et InhA (S94A): NADH (à la fois en vert) montre clairement la mutation D148G et 90 rotation de Phe149 résultant. Superposition de InhA (D148G): NADH (Bleu) et InhA: NAD-INH (Code PDB 1Z1D: Pink) montre que, dans ce cas, Phe149 occupe la même position et explique pourquoi InhA (D148G) est encore sensible à l'inhibition par l'isoniazide . Fait intéressant, Phe149 dans le mutant InhA (D148G) adopte la même orientation que InhA et InhA (S94A) dans un complexe avec INH-NADH (Dias et al, 2007 Rozwarski et al, 1999 Vilcheze et al, 2006). Ainsi, dans le mutant InhA (D148G), Phe149 est naturellement placé pour Pi-empilant avec le fragment INH ce qui explique la MIC inchangée observée pour l'isoniazide contre-type sauvage InhA et l'INHA (D148G) mutant in vivo (figure 5). En outre, la rotation de la chaîne latérale Phe149 dans l'INHA (D148G) mutant entraîne également l'ouverture d'un canal d'eau permettant l'ajout de deux molécules d'eau dans le site actif, ainsi que l'augmentation de la distance entre l'anneau de nicotinamide de NADH et l'anneau de Phe149, ce qui conduit à une diminution de l'affinité NADH comme confirmé par des études cinétiques (figure 5). Les mêmes changements structurels très probablement aussi expliquer la diminution de la sensibilité des InhA (D148G) à pyridomycin par rapport au type sauvage comme NADH et pyridomycin partagent une poche de liaison similaire. DISCUSSION Pour inhiber ou tuer des organismes concurrents, de nombreux microbes produisent et sécrètent des produits naturels avec une activité antibiotique. Cette riche source de composés chimiquement divers a été exploité avec succès pour la production de nombreux médicaments anti-microbienne et anti-cancer dans les premières décennies du développement des antibiotiques, mais a ensuite été abandonné (Fischbach Walsh, 2009). Étant donné que la pression sélective conférée par certains antibiotiques ayant une activité à large spectre peut avoir conduit la résistance dans d'autres bactéries qui partagent la même niche écologique à l'état naturel, de nombreuses molécules potentiellement bio-actifs peuvent avoir été négligés (Smith et al, 2010). Les forces écologiques et évolutifs qui ont façonné les produits naturels, en particulier la sélection et l'inhibition des cibles vulnérables, restent inconnues mais la compréhension de cette relation est importante pour la découverte de médicaments. Le traitement de la tuberculose est de plus en plus menacée par l'émergence de souches résistantes aux médicaments de M. tuberculosis et cela a conduit à un regain d'intérêt à trouver de nouveaux inhibiteurs de bactéricides. Comme dans d'autres domaines anti-infectieux, les écrans d'objectifs ont été infructueuses incitant les chercheurs à adopter le dépistage de cellules entières une fois de plus (Cole Payne et al, 2007). Par conséquent, nous reinvestigating produits naturels divers pour la production de succès que ces composés ont été optimisés par l'évolution en tant qu'agents antibactériens. Dans cette étude, nous avons utilisé pyridomycin, un produit naturel ayant une activité anti-mycobactériens, d'identifier la cible intracellulaire et caractérisé par son mécanisme d'action. Pyridomycin a été décrite pour la première en 1953 (Maeda et al, 1953), peu de temps après l'introduction de l'isoniazide dans la pratique clinique, mais a ensuite été apparemment négligé. Dans une coïncidence remarquable, nous montrons que, comme l'isoniazide, pyridomycin directement la cible énoyl dépendante du NADH (ACP) réductase InhA et provoque une inhibition par compétition pour la poche de NADH contraignant. InhA (également connu sous le nom FabI) est un composant essentiel du système de synthase des acides gras de type II (FasII) impliqués dans l'acide gras d'allongement et est nécessaire pour la production mycolate dans M. tuberculosis. Le système FasII est hautement conservée dans les bactéries, mais absent de l'homme qui en fait une cible attrayante de la drogue (Heath et al, 2002 McMurry et al, 1998 Vilcheze et al, 2006. 2011). Bien que l'isoniazide est certainement l'inhibiteur connu la plus efficace de InhA chez M. tuberculosis. il est un pro-médicament nécessitant une activation par le KatG catalase Rock, 2008). Nos résultats suggèrent que pyridomycin est le produit naturel le plus puissant pour inhiber spécifiquement FasII chez M. tuberculosis et la résistance se pose en raison de remodelage du site NAD-obligatoire dans InhA, notamment par mutation D148G. Pharmacologiquement validées cibles médicamenteuses sont rares dans M. tuberculosis avec InhA parmi les meilleurs (Lamichhane, 2011). Pour cette raison, plusieurs tentatives ont été faites pour développer des inhibiteurs hétérocycliques qui diffèrent de l'isoniazide et l'éthionamide dans leur structure et leur activité. Des exemples comprennent les composés contenant du bore hétérocycliques (de diazaborine) qui réagissent avec le ribose de NAD pour former des produits d'addition diazyborine-NAD qui inhibent InhA est similaire à l'INH-NAD (Baldock et al, 1996). les analogues de Triclosan (Freundlich et al, 2009 Vilcheze et al, 2011) et des composés d'éther diphényle (Sullivan et al, 2006) se sont avérés inhiber InhA avec nanomalar K i et MICs micromolaires et sont tous deux des candidats prometteurs en tant que composés antituberculeux . Des études de dépistage plus pour les inhibiteurs Escherichia coli Fabi ont également révélé des structures nouvelles efficaces, dont beaucoup cependant ne disposent pas de bonne MIC contre M. tuberculosis (Lu Payne et al, 2002). Il est à noter que, alors que le système FasII est présent dans la plupart des bactéries, pyridomycin est un inhibiteur spécifique de l'espèce mycobactérienne (tableau 1). Parmi les mycobactéries testé ici, les protéines InhA partagent un niveau élevé d'identité de séquence (77) et les deux Asp148 et Phe149 (ainsi que d'autres résidus de sites actifs) sont strictement conservées, ce qui peut expliquer pourquoi tous les mycobactéries étaient sensibles à l'antibiotique. En outre, d'autres mycobactéries pathogènes tels que M. leprae et M. ulcerans partagent également près de protéines InhA identiques (91 et 93 identité à la tuberculose orthologue M., respectivement) et devraient être sensibles à pyridomycin (Informations complémentaires Fig 1). Le degré d'identité de séquence entre M. tuberculosis et InhA FabI des différentes bactéries Gram-positives et Gram-négatives testées ici est beaucoup plus faible, allant de 27 à 33. Ni Asp148 ni Phe149 sont conservées dans ces enzymes, ce qui explique probablement leur résistance pyridomycin. Il est possible que, grâce à cohabitant avec les producteurs de pyridomycin, ou un produit naturel lié, les ancêtres de ces bactéries peuvent avoir acquis une résistance à l'antibiotique comme il a été proposé pour arylomycin, un produit naturel qui inhibe le signal peptidase I (Smith et al, 2010 ). L'émergence croissante de la résistance à l'isoniazide dans les isolats cliniques de M. tuberculosis est un problème important pour la thérapie de la tuberculose et compromet l'efficacité du traitement en cours au sérieux. Dans 50 Yew, 2009). Nos données montrent clairement que pyridomycin ne nécessite pas d'activation. Ceci est particulièrement important car cela signifie que pyridomycin peut effectivement tuer résistante à l'isoniazide M. tuberculosis portant des mutations katG comme démontré par nos tests de sensibilité des isolats cliniques isoniazide résistant. Le résistant pyridomycin souche PYR7, qui porte la mutation D148G dans InhA, est pas de résistance croisée à l'isoniazide et éthionamide alors, à l'inverse, la variante S94A qui affiche résistance à l'isoniazide reste sensible aux pyridomycin (figure 2). Cela donne à penser que, si les deux pharmacophores sont des inhibiteurs compétitifs de la liaison du NADH, ils se lient à la poche de différentes manières. En outre, l'absence de résistance croisée avec le triclosan, l'échafaud pour d'autres programmes d'inhibiteur de INHA est prometteuse car elle démontre qu'il existe de multiples façons d'inhiber la même protéine sans résistance croisée se produise. Ces résultats sont importants pour la conception rationnelle de médicaments et pourrait conduire à l'élaboration de pyridomycin dérivés qui tuent plusieurs mycobactéries contrairement à l'isoniazide, ce qui est efficace uniquement contre M. tuberculosis. MATERIELS ET METHODES Informations générales souches bactériennes, des conditions de culture, pyridomycin production et la purification, l'expression et la purification des protéines et les détails des matériaux sont décrits dans le soutien des matériaux d'information et méthodes. Détermination de la CMI pyridomycin La sensibilité aux médicaments des bactéries a été déterminée en utilisant l'essai de microtitrage résazurine (REMA Palomino et al, 2002). En bref, les bactéries en phase logarithmique ont été diluées à une DO 600 de 0,0001, et ont été cultivées dans une plaque à 96 puits en présence de dilutions en série de composés. Après 10 générations (7 jours pour M. tuberculosis) viabilité bactérienne a été déterminée en utilisant 10l de résazurine (0,025 w / v), et calculé en pourcentage du chiffre d'affaires résazurine en l'absence de composé. Méthodologie pour la détermination de l'activité minimale bactéricide (MBC) et l'activité intracellulaire sont décrits dans les documents à l'appui de l'information et des méthodes. Isolement et caractérisation des clones résistants à H37Rv pyridomycin mutants de H37Rv Pyridomycin résistantes ont été isolées par étalement 10 9 CFU sur milieu contenant 7H10 solide 3C), les colonies ont été prélevées et cultivées dans un milieu sans 7H9 pyridomycin. Les colonies ont ensuite été retestés pour leur sensibilité à pyridomycin, moxifloxicin, isoniazide et la rifampicine. Pyridomycin résistant clone PYR7 a été sélectionné pour le séquençage du génome entier en utilisant la technologie Illumina et lit aligné sur la séquence du génome du génome parent H37Rv pour identifier les SNPs (protocoles décrits dans le soutien des matériaux d'information et méthodes). Le SNP dans inhA a été validé par un séquençage Sanger classique en utilisant un analyseur génétique ABI3130XL (Applied Biosystems). Détermination de la MIC résistante à l'isoniazide isolats cliniques Neuf isolats cliniques isoniazide résistant qui étaient cinq (HUG). Les isolats ont été cultivées jusqu'à la phase logarithmique moyenne en milieu liquide et testés pour leur pyridomycin, l'isoniazide et la moxifloxacine sensibilité par REMA. Surexpression de inhA en H37Rv et PYR7 Pour valider génétiquement que InhA a été la cible de pyridomycin, l'impact de la surexpression de type sauvage InhA ou les formes mutantes dans les souches H37Rv et PYR7 a été déterminée. En bref, rapide mutagénèse changement de site dirigée a été utilisée avec pMVInhA où inhA est exprimé à partir du promoteur hsp60 dans pMV261 (Larsen et al, 2002) pour introduire t280g ou a443g mutations générant ainsi pMVInhA (S94A) et pMVInhA (D148G), respectivement (amorces dans le soutien de l'information Tableau 1). Plasmides pMVInhA, pMVInhA (S94A) et pMVInhA (D148G) ont été transformées en H37Rv et PYR7. Les transformants ont été sélectionnés en utilisant la kanamycine, puis vérifié par PCR de colonies pour la présence de la cassette de résistance à la kanamycine, avant de déterminer la CMI pour pyridomycin, de l'isoniazide et de la moxifloxacine par REMA. L'inhibition de la synthèse des acides mycoliques par pyridomycin L'inhibition de la production d'acide mycolique par pyridomycin et l'isoniazide a été déterminée comme décrit précédemment (Vilcheze et al, 2006). II. III. IV.
